Molecular and Immunohistochemical Detection of Epstein - Barr Virus among Sudanese patients with Lymphomas and Nasopharyngeal Carcinoma in Khartoum State –Sudan

Abstract

Abstract Epstein Barr virus is a very common virus that is already infecting high percent of population worldwide and persisting for the lifetime in the host. It is usually acquired in early childhood in developing countries and results of several studies have suggested a probable etiologic association between Epstein-Barr virus (EBV) and lymphoma and nasopharyngeal carcinoma; multiple EBV proteins can be expressed in infected lymphocytes, among which Latent membrane protein-1(LMP-1) is thought to be most important for transformation, therefore, the aim of this study was to investigate the association of LMP-1 EBV in theses tumors in Sudan This retrospective and prespective study was conducted in Khartoum State –Sudan , the geographical and histoclinical data were achieved from the patients files , and Formalin –fixed paraffin embedded biopsies of one hundred and thirty five (135) of malignant lymphoma and nasopharyngeal carcinoma tissues (case group) and normal and reactive tissues (control group ) , samples were used to investigate the positive rate of EBV, by anti (LMP-1) Immunostain according to Ventana auto stainer machine protocol (Ultra View™) and Standard Strepto Avididin Biotin (Thermo Fisher) protocol , and by polymerase chain reaction (PCR) , The PCR primers targets the EBV gene encoding the viral latent membrane protein one (LMP-1) ware applied in the study. The data was analyzed, using the statistical programs software Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) version (11.5), Chi square test and different statistical measures were calculated. Positive (LMP-1) Immunostain reaction for EBV, were reported in (32%) (34/105) among malignant tissues, compared with (13%) (4/30) of nonmalignant tissue, the (P.value= 0.04) ; while the positive PCR for EBV were reported (43.8%) (46/105) in malignant tissues, compared with (23.3%) (7/30) in non malignant tissue, the (P.value= .0.043). Regarding lymphoma, LMP-1 immunohistochemistry, positive rate was (45%) (5/11) for HL, and (31%) (18/59) for non Hodgkin lymphoma, there was no statistically significant difference between HL and non HL existed as regard to association of EBV as the (P.value= 0.333). The same finding but slightly higher was obtained by PCR (63.6) (7/11) and (37.3%) (22/59), for HL and non HL respectively. Also the study showed that, the malignant lymphomas had higher incidence in male than female and most commonly affected age group was children and young adults and the most predominant subtypes was Non Hodgkin lymphoma. Considering nasopharyngeal carcinoma, males were more affected than females, the most commonly affected age group was middle age and elderly and the predominance subtype was non keratinized squamous cell carcinomas. As regard to histological subtypes of NPC, the PCR detected EBV DNA in (100%) (9/9), (43%) (3/7) and (24%) (5/19) of undifferentiated squamous cell carcinoma , keratinized squamous cell carcinoma and in Non keratinized squamous cell carcinoma respectively ,(P.value =0.001) , while the LMP-1 immunostain reveal positive rate of EBV of (55%, 28% , 21%) for the above subtypes , with (P.value= 0.182,) The study concluded that, there is sufficient evidence for the carcinogenicity of EBV in the causation of lymphomas and nasopharyngeal carcinomas, also the study concluded that PCR was more sensitive in detecting EBV. The study recommended to adopt EBV screening program, and to conduct further studies to find out whether the carcinogenicity of EBV need co-infection or not.

ملخص البحث يعتبر فيروس الEBV من أكثر الفيروسات انتشارا على نطاق العالم, حيث يصيب الاطفال فى الغالب الاعم خصوصا فى الدول النامية , ترجح الكثير من نتائج الدراسات البحثية وجود علاقة سببية بين وجود فيروس (EBV ) وسرطان الغدد اللمفاوية و سرطان البلعوم الانفى. لهذا السبب اجريت هذه الدراسة فى السودان للتحرى عن اثبات او نفى هذه العلاقة . اجريت هذه الدراسة الاسترجاعية الآنية فى السودان(ولاية الخرطوم) , حيث جمعت المعلومات الجغرافية والاكلينيكية من سجلات وملفات المرضى, ومن ثم اخذت الخزعات النسيجية المحفوظة فى البرافين من الارشيف المختبرى, حيث تم اخذ مائة وخمس وثلاثون خزعة وكانت على النحو التالى: سبعون من سرطان الغدد اللمفاوية وعشرون من الغدد اللمفاوية الطبيعية والنشطة كما اخذت خمس وثلاثون خذعة نسيجية من سرطان البلعوم الانفى وعشرة من النسيج طبعى للبلعوم الأنفى, للكشف عن وجود هذا الفيروس ,اجريت تقنيتان نسيجيتان وهما تقنية المناعة الكيميائية النسيجية حسب مفهوم شركة ثيرمو وتقنية البيلوجيا الجزيئية لمضاعفة الحمض النووى حسب مفهوم شركة انترون, تم تحليل النتائج بطريقة كاى التربيعى بواسطة البرنامج الاحصائى للحزم الاجتماعية. كشفت تقنية المناعة النسيجية عن وجود الفيروس بنسبة)32%)) 34\105 ( من سرطانات الغدد اللمفاوية وسرطان البلعوم الانفى , فى حين كانت نسبة تواجده فى الانسجة غير السرطانية ( عينة السيطرة) بنسبة (13%) ( 4\30) والقيمة الاحتمالية للارتباط كانت (O.043) , بينما النتائج البيلوجية الجزيئية لمضاعفة الحمض النووى للفيروس كانت على النحو التالى( 43.8% )(46\105) لعينة الدراسة و (23.3%)( 7\30) لعينة السيطرة والقيمة الاحتمالية للارتباط كانت (0.04 ) مما يدل على وجود فروقات معنوية ذات دلالة إحصائية. مايلى سرطان الغدد اللمفاوية: كانت نسبة تواجد الفيروس فى هذا السرطان هى (45%) (5 \11) لسرطان (HL)ونسبة (31%) ( 18\59) لسرطان (NHL) حسب تقنية المناعة الكيميائية النسيجية و اما طريقة كشف الحمض النووى لنفس السرطانات سابقة الذكر كانت ( 63.6% و 37.3% ) لHL)) و NHL)) على التوالى , حيث لاتوجد فروقات معنوية ذات دلالة احصائية إذ ان القيمة الاحتمالية للارتباط كانت (0.333), اوضحت الدراسة ايضا أن سرطان الغدد اللمفاوية اكثر تواجدا فى الرجال ودائما يصيب الاطفال ومتوسطى الاعمار, كما أن ال NHL)) هو النوع الاكثر إنتشارا. مايلى سرطان البلعوم الانفى, فإن هذا السرطان أكثر إنتشار بين الرجال , ودائما ما يصيب متوسطى الاعمار وكبار السن, اوضحت الدراسة كذلك ان سرطان الخلايا الحرشفية غير المتقرنة هو أكثر الانواع النسيجية انتشار. عند مقارنة ترافق فيروس الEBV مع الانواع النسيجية لسرطان البلعوم الانفى , اظهرت تقنية مضاعفة الحمض النووى, فروق ذات دلالة احصائية للاارتباط ( (0.000الفيروس بدرجات متفاوتة مع تصنيفات السرطان النسيجية , حيث كان تواجده بنسبة ( 100% و 43% و 24% ) لسرطان الخلايا الحرشفية غير المتمايز وسرطان الخلايا الحرشفية غيرالمتقرنة وسرطان الخلايا الحرشفية المتقرنة, على التوالى, بينما كانت نسبة تكرار الفيروس بإسعمال تقنية المناعة الكيميائية النسيجية لنفس الانواع آنفة الذكر كالآتى ( 55%و28% و21%) مع عدم وجود فروقات ذات دلالة احصائية حيث ان القيمة الإحتمالية كانت ( 0.182). هنالك دلائل كافية تشير لوجود علاقة بين الاصابة بفيروس الEBV وسرطان الغدد اللمفاوية والبلعوم الانفى و اكدت الدراسة على ان تقنية تضاعف الحمض النووى للفيروس كانت اكثر حساسية من الطريقة المناعية الكيميائية النسيجية للكشف عن ذات الفيروس, أوصت الدراسة بالقيام بى برنامج مسح عام للكشف عن الفيروس وسط فئات المجمتع, اوصت الدراسة بإجراء دراسات مستفيضة لتوضح عما إذا كان هذا الفيروس يحتاج لاخماج مساعدة للقيام بعملية التسرطن ام لا.