Molecular Characterization of Ciprofloxacin Resistance DNA gyrA and gyrB, parC and parE genes among Proteus mirabilis Isolated from Urine Specimens in Khartoum state- Sudan

Abstract

ABSTRACT

Background: Urinary tract infections (UTI) are major health problems affecting millions of people each year. As an opportunistic pathogen Proteus mirabilis causes urinary tract infections, ciprofloxacin is a recommended drug for the treatment of UTIs, but a progressive increase in fluoroquinolone resistance has been seen in clinical isolates. The study was a qualitative study, aimed to highlight the importance of using conventional and molecular techniques in the detection of different mutations within the genome of Proteus mirabilis isolates. Methods: In this study a total of (3895) specimens were collected from patients with symptoms of UTIs attending different hospitals in Khartoum State during the period from June 2016 to May 2017. Midstream urine samples were collected and cultured for UTI diagnosis and ciprofloxacin susceptibility. Then polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) and sequencing was performed for detection of GyrA, GyrB, ParC and ParE genes mutations of isolated P. mirabilis. Results: The findings of this study suggested high prevalence of UTIs among females (53.5%) compared to males (46.5%). P. mirabilis was isolated from (3.1%) patients, with different ratio (females, 55:males, 45), occurred highest in the age group (11 – 49 years). UTI is commonly caused by a range of pathogens, but most commonly by Escherichia coli (56.1%) followed by Klebsiella pneumoniae (18.0%), Enterococcus faecalis (9.9%), Pseudomonas aeruginosa (8.9%), Proteus mirabilis (3.1%), Proteus vulgaris (2.2%), Citrobacter spp. (0.8%), Staphylococcus epidermidis (0.6%) and Staphylococcus aureus (0.4%). The target urinary isolates reflected high resistance to ciprofloxacin (71.7%), whilst P. mirabilis shown (30%) resistant to ciprofloxacin. Mutations associated with ciprofloxacin resistance P. mirabilis in GyrA (Ser 83 to Ile) and ParC (Ser 81 to Ile). Also it revealed silent mutations at following codons of GyrB (474 leucine, 585 valine, 612 histidine and 639 asparagine) and ParE (469 isoleucine, 531 aspartic and 533 glycine). Conclusion: Only one or two mutations in both GyrA and ParC genes of Proteus mirabilis are necessary to obtain resistance to ciprofloxacin, ParC is important as GyrA to cause resistance susceptibility to ciprofloxacin in Proteus mirabilis and In Proteus mirabilis the silent mutation in QRDR regions is not enough for ciprofloxacin resistance.

ملخص الدراسة

خلفية الدراسة : يعتبر التهاب المسالك البولية من اكبر المشاكل الصحية التي تصيب أكثر من مليون شخص سنويا. تسبب المتقلبه الرائعه التهاب المسالك البولية كنوع من الاصابة الانتهازية, يعتبر السيبروفلوكساسين احد الادوية الموصى بها لعلاج التهاب المسالك البولية, ولكن لوحظ زيادة مطردة في مقاومة الفلوروكينولون في البكتريات المعزوله سريريا. كانت الدراسة عبارة عن دراسة نوعية ، تهدف إلى تسليط الضوء على أهمية استخدام التقنيات التقليدية والجزيئية في الكشف عن الطفرات المختلفة داخل الجينوم المتقلبة الرائعة. طرق الدراسة: في هذه الدراسة تم جمع (3895) عينه من مرضي تظهرعليهم أعراض التهاب المسالك البولية من مستشفيات مختلفة داخل ولاية الخرطوم في الفتره من يوليو 2016 الي مايو 2017. تم جمع العينات من منتصف البول وزرعت لتشخيص اللتهاب المسالك البولية و اختبار حساسية السيبروفلوكساين. ثم تم اجراء تفاعل البلمرة المتسلسل PCRو RFLP و التسلسل الجيني للكشف عن الطفرات الجينية GyrA ، GIRB ، ParC و ParE من المتقلبة الرائعه معزولة. النتائج: تشير النتائج إلي ارتفاع معدل انتشارعدوى المسالك البولية بين الإناث مقارنة مع الذكور بنسب (53.5% : 46.5%) كما تم عزل المتقلبة الرائعة من (3.1%) مريض, بنسبة مختلفة (55 إناث :45 ذكور), اعلي معدلات للإصابة في مجموع الأعمار من (11-49 سنه). تحدث عدوى المسالك البولية عادة عن طريق مجموعة من مسببات الأمراض، ولكن أكدت النتائج وجود الاشرشيا القولونية بين المرضى السودانيين بنسبة عالية (56.1%) تليها الكليبسيلا الرئوية (18.0 %) ، المكورة المعوية البرازية (9.9%), الزائفة الزنجارية (8.9%)، المتقلبة الرائعة ( 3.1%)، المتقلبة الشائعة (2.2%)، أنواع الليمونية (0.8%)، ،الكرويّة العنقودية الجلديّة (0.6%) وأقل نسبة للبكتيريا المعزولة كانت للمكورة العنقودية الذهبية (0.4%)، البكتريا المعزولة المستهدفه في دراستنا عالية المقاومة للسيبروفلوكساسين (71.7%), في حين ان(30%) من المتقلبة الرائعة مقاومة للسيبروفلوكساسين. تم تحديد الطفرات المرتبطة بمقاومة السيبروفلوكساسين في المتقلبة الرائعة فيGyrA (تغير السيرين في الكودون 83 إلي ايزوليوسين) و(السيرين في الكودون 81 إلي ايزوليوسين) من ParC. وكشف عن طفرات صامتة في الكودونات(474ليوسين، 585 فالين ، 612 هيستدين و639الأسباراجين) منGyrB و ( 469 ايزوليوسين, 531 اسبارتيك و 533 جلايسين) منParE. الخلاصة: وجود طفره جينيه واحده او اثنين في GyrAاو ParC من المتقلبه الرائعة مهم لايجاد مقاومه لليبروفلوكساسين, يعتبر ParC مهم مثلGyrAحيث يقلل حساسية البكتريا للسيبروفلوكساسين وكما ان الطفرة الصامتة في مناطق QRDR لا تكفي لمقاومة السيبروفلوكساسين في المتقلبة الرائعة